Е.Е. Давыдова, И.В. Солтынская, И.А. Федорова, Н.В. Ярыгина, Н.А. Яшина, И.Л. Обухов,
Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (Москва)
Ключевые слова: генетические тесты, наследственные болезни
https://cyberleninka.ru/article/n/prime ... ek-i-sobak
Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ДТБС — дисплазия тазобедренного сустава, п.н. — пар нуклеотидов, ПЦР —полимеразная цепная реакция, ЦМД — Центр молекулярной диагностики, AD —autosomal dominant inheritance (аутосомно-доминантный тип наследования), AHT — Animal Health Trust Center (Центр охраны здоровья животных), AR — autosomal recessive inheritance (аутосомно-рецессивный тип наследования), HCM — hypertrophic cardiomyopathy (гипертрофическая кардиомиопа-тия), PLL — primary lens luxation (первичный вывих хрусталика), PRA — progressive retinal atrophy (прогрессирующая атрофия сетчатки), SMA — spinal muscular atrophy (спинальная мышечная атрофия), SNP — single nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)
Введение
Породистые животные в большей степени, чем дикие, подвержены наследственным заболеваниям, что вызвано ограничением генетического разнообразия за счет инбридинга. При закреплении желаемых признаков в породе нередко накапливаются опасные мутации, наследуемые по аутосомно-рецессивному пути. Выявление подобных мутаций у животных затруднено, так как болезнь может не проявляться у нескольких поколений.
Невозможно переоценить значение молекулярногенетической диагностики в борьбе с наследственными болезнями. Выявлены тысячи генетических мутаций, обусловливающих указанные болезни, в том числе и у животных. Генетическое тестирование в диагностических целях широко применяют по всему миру; наиболее крупные зарубежные ветеринарные центры, занимающиеся генетическим тестированием, — это Laboklin (Германия), IDEXX (Канада), Animal DNA Testing (Австралия), VetGen (США), Veterinary Genetics Lab (США). Они предлагают разнообразные исследования, ДНК-тесты для домашних, сельскохозяйственных и даже диких животных с целью выявления генетической предрасположенности к наследственным болезням, носительства определенных фенотипических признаков, а также получения генетического паспорта, содержащего информацию о генетической индивидуальности животного.
Генетические мутации могут иметь разный характер — однонуклеотидные замены, делеции, инсер-ции в кодирующей области генов, мутации в области сплайсинг-сайтов, протяженные делеции, приводящие к нарушению экспрессии сразу нескольких генов [4, 6...9, 11...15, 17...22, 24].
Любой ДНК-тест основан на независимом выявлении мутантной и нормальной копий генома. Здоровые животные имеют только нормальные копии гена (гомозиготны по нормальной копии). Носители заболевания с АБ наследованием имеют одну копию нормального и одну копию дефектного гена (гетерозиготны по мутации). Животные с клинически проявляющимся АБ наследуемым заболеванием имеют две копии дефектного гена (гомозиготны по мутации). Заболевание с AD наследованием, например поликистоз почек у кошек персидской породы, проявляется даже при наличии в геноме одной дефектной копии гена. В некоторых случаях, например НСМ породы мейн-кун, отмечено неполное доминирование, то есть при наличии мутации в гетерозиготном состоянии вероятность развития болезни невысокая, при гомозиготной мутации риск значительно увеличивается.
Отсутствие информированности о проблеме генетических болезней в прошедшие десятилетия привело к массовому завозу в Россию животных-произ-водителей с генетическими мутациями. По некоторым данным, носителями мутаций, вызывающих РБА, являются более 70 % собак породы энтлебухер зен-ненхунд, 50 % такс, около 20 % отечественных лабрадоров [1]; носителями мутации, ответственной за развитие РЬЬ, — 66 % миниатюрных бультерьеров, при этом гомозиготны по мутации 15 % животных [25]. Среди кошек пород персидская и экзотическая короткошерстная в Англии, Германии, Франции и Австралии 37.50 % подвержены поликистозу почек — болезни, характеризующейся развитием множественных кист в почках и почечной недостаточностью [2, 3, 5].
Лаборатории, применяющие генетические тесты в диагностике наследственных болезней, появились и в России. В данной статье описано применение ряда ДНК-тестов, разработанных в ЦМД ФГБУ «ВГНКИ», для выявления наследственных заболеваний породистых кошек и собак.
Цель исследования
Проследить динамику распространенности наследственных заболеваний породистых кошек и собак в России, определить эффективность применения ДНК-тестирования в борьбе за снижение численности животных — носителей опасных мутаций.
Материалы и методы
Для получения генетического материала использовали соскобы эпителиальных клеток с внутренней поверхности щек и десен животных. ДНК выделяли с использованием набора «ДНК собрС» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии.
Для выявления большинства однонуклеотидных полиморфизмов, SNP, в том числе PKD1 C10063A [17], MYBPC G93C [20], MYBPC C2460T [21], CMAH С-371Т, A-217G, T265A G1600A [4], FGF5 c.356insT, C406T, c.474delT, A475C [13], PKLR c.693+304G>A [8], TYRP1 C8G, 1262+5 G>A, C298T [22], TYR G940A, G715T [18], MLPH T83del [12] в геноме кошек и ADAMTS17 c.1473+1G^-A [6], PRCD c.5G^A [24], vWF7639G^A [11], vWF88delG [14] в геноме собак, использовали метод пиросеквенирования, позволяющий определять нуклеотидную последовательность коротких, 10.30 п.н., фрагментов генома. В работе использовали систему генетического анализатора «PyroMark Q96 MD» с реагентами производства «QIAGEN».
Для выявления мутации CEP290 IVS50 + 9T>G [19] в гомополимерной области генома кошек, (Т)9 повтор, использовали метод секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3130», «Applied Biosystems». Реакцию секвенирования проводили по методу cycle sequence на амплификаторе «GeneAmp PCR System 2720» («Applied Biosystem», США), набор «Big Dye® Terminator v1.1.Cycle Sequencing Kit».
Для выявления LIX1-LNPEP (140000 п.н. делеции) [7] использовали ПЦР-идентификацию с праймерами, фланкирующими область делеции, и с праймерами в области нормальных LIX1 и LNPEP генов.
При выборе олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих области мутаций, учитывали особенности используемых методик — ПЦР, пиросеквенирова-ние, секвенирование по Сенгеру. Использовали программное обеспечение «PSQ Assay Design 1.06», «Bio-tage», «Primer Premier 5.0», «Primer Select DNAstar».
Результаты и обсуждение
ДНК-тесты были разработаны с учетом накопленных в научной литературе данных о генетических полиморфизмах, ответственных за проявление фенотипа и предрасположенности к наследственным заболеваниям домашних животных. На основании разработанных тестов выявляют мутации, обусловливающие но-сительство определенных окраса, длины шерсти, группы крови, а также наследственные болезни породистых кошек и собак (табл. 1, 2).
Результаты исследования кошек. По результатам проведенных в 2007—2011 гг. исследований с помощью ДНК-тес-та «PK» установлено, что примерно 30 % отечественных кошек пород персидская и экзотическая короткошерстная имеют в геноме мутацию PKD1 C10063A в гетерозиготном состоянии, вызывающую развитие поликистоза почек. В 2012 г. численность кошек, несущих данную генетическую аномалию, сократилась до 16 % (рис.). В меньшей степени подвержены наследственному поликистозу почек кошки пород британская короткошерстная и шотландская вислоухая, имеющие родственные связи с персидской
кошкой. Среди проверенных 152 животных указанных пород, 7 британских короткошерстных и 2 шотландские вислоухие кошки (около 6 % от общего числа) имели мутацию РК01 С10063А в гетерозиготном состоянии.
Необходимо отметить, что мутация РКЮ1 С10063А встречается в геноме животного только в гетерозиготном состоянии, это объясняется невозможностью полноценного развития организма при наличии двух мутантных копий гена.
Известно, что у многих пород кошек — мейн-кун, рэгдолл, сфинкс, британские, американские короткошерстные, шотландские вислоухие и норвежские лесные развитие серьезной патологии сердца, НСМ, обусловлено наследственными причинами. НСМ человека имеет муль-тифакторное наследование — за развитие данной патологии отвечают более 1000 мутаций, локализующихся в 10 генах. Учитывая этот факт, можно предположить, что развитие НСМ у кошек также связано с рядом генетических патологий. Однако пока известны только две мутации в гене миозин-связывающего белка туЬС, вызывающие данное заболевание у пород мэйн-кун (С93С) и рег-дол (С2460Т). Мутация С2460Т может вызывать НСМ и у человека [21]. У кошек таких пород, как бенгальские, сибирские, дэвон рекс, сфинкс, мутации С93С и С2460Т либо не встречаются, либо встречаются очень редко. Генетические причины, вызывающие НСМ у данных пород, неизвестны.
В настоящее время диагностическая ценность мутации С93С, характерной для породы мейн-кун, оспаривается, так как не наблюдается полной корреляции между результатами ДНК-тестирования и ультразвуковой диагностики. Согласно опубликованным данным, 75 % кошек данной породы с диагнозом НСМ имеют нормальную копию гена в области мутации [23]. Вероятная причина развития НСМ в этих случаях — существование других, пока не выявленных мутаций. В других случаях клиническая картина заболевания у животных, несущих мутацию С93С, развивается медленно; по литературным данным, 17 % из них остаются здоровыми в возрасте 4.6 лет [23]. В любом случае ДНК-тестирование «НСМ» и исключение животных с мутацией С93С из племенной работы способствует снижению риска развития заболевания среди мейн-кунов.
По нашим данным, более 40 % отечественных кошек породы мейн-кун являются носителями мутации в гетерозиготном состоянии (табл. 3).
Рис.
Результаты тестирования на наличие предрасположенности к поликистозу почек кошек пород персидская и экзотическая короткошерстная
Период, г. Количество животных
Всего Без мутации Гетерозигота Гомозигота
2007 215 146 69 0
2008 192 139 53 0
2009 227 165 62 0
2010 166 116 50 0
2011 292 205 87 0
2012 288 241 47 0
РВЖ • МДЖ • № 3/2013
1. Перечень ДНК-тестов для определения генетического носительства фенотипических признаков и предрасположенности к наследственным болезням домашних кошек
ДНК-тест Заболевание, фенотип Наследование Ген Мутация Характер изменений Порода
«РК» Поликистоз почек AD PKD1 С10063А [17] В кодирующей области преждевременный стоп-кодон Американские и британские короткошерстные, Гималаи, персы, рэгдолл, экзоты, кроссбреды, скоттишфолд
«НСМ» НСМ AD (неполное) MYBPC G93C [20] В кодирующей области аминокислотная замена Мейн-кун
<6МА» SMA AR LIX1-LNPEP С2460Т [21] То же Регдолл
«PRA» Поздняя PRA AR СЕР290 140000 п.н. делеция [7] Нарушение экспрессии нескольких генов Мейн-кун
«РК^еЬ> Дефицит пируваткиназы AR PKLR IVS50+ 9T>G [19] Нарушение сайта сплайсинга Абиссинская, оцикет, сомали, американский керл, бенгальская, корниш-рекс, ориентальная короткошерстная, сиамская, сингапура, американская короткошерстная, петерболд и др.
«В1» Группа крови AR СМАН c.б93+304G>A [8] То же Абиссинская, бенгальская, ла перм, мейн-кун, норвежская лесная, саванна, сибирская, сингапурская, сомали и др.
«Наіг» Длина шерсти кошек AR FGF5 С-371Т, A-217G, 18indeL-53, Т265А G1б00A [4] Ряд мутаций в регуляторной и кодирующей областях Все породы
«Локус А» Равномерность окраса, агути AR ASIP с.356іпбТ, С406Т, c.474deLT, А475С [13] Ряд мутаций в кодирующей области, любая из них приводит к изменению фенотипа То же
«Локус В» Шоколадный цвет AR TYRP1 СAdeLl22-123 В кодирующей области делеция двух нуклеотидов »
Цвет циннамон AR C8G 1262+5 G>A [22] В кодирующей области аминокислотная замена и нарушение сайта сплайсинга Все породы, кроме оцикет
«Локус С» Сиамский окрас AR TYR С298Т [22] В кодирующей области преждевременный стоп-кодон То же
Бурманский окрас AR cb=G715T [18] То же »
«Локус Д» Ослабление окраса AR М^РН T83deL [12] В кодирующей области делеция одного нуклеотида »
Как уже упоминалось, для этих животных риск развития болезни низкий, НСМ наследуется с неполным доминированием. Однако около 5 % исследованных животных имеют гомозиготный по мутации С93С генотип, что свидетельствует о высоком риске развития кардиомиопатии. Проведенный опрос владельцев таких животных показал, что у большинства кошек признаки НСМ развивались в возрасте до двух лет. В отдельных случаях котята умирали в возрасте до трех месяцев с симптомами острой сердечной недостаточности, сопровождающейся отеком легких.
Другое наследственное заболевание кошек, характерное для породы мейн-кун, — SMA. Это АК-наследуе-мое заболевание обусловлено генетической аномалией в хромосоме А1-делецией 140 000 п.н., приводящей к нарушению экспрессии генов ЫХ1 и LNPEP. В случае присутствия в геноме гомозиготной SMA-мутации у животного с высокой вероятностью развивается мышечная атрофия в результате дегенерации и гибели двигательных нейронов спинного мозга. В течение 2012 г. на носитель-ство данной мутации было исследовано 53 кошки, только 2 из них (около 4 %) оказались носителями мутации, ни одного животного с SMA-мутацией в гомозиготном состоянии не выявлено (см. табл. 3). Независимо от небольшого числа исследованных животных, очевидно, что мутация не имеет широкого распространения.
Результаты исследования собак. Собаки разных пород также подвержены разнообразным наследственным патологиям, в том числе аномалиям опорно-двигательного аппарата, неврологическим болезням, заболеваниям сердечно-сосудистой и иммунной систем, обмена веществ и др.
Такая часто встречающаяся среди немецких овчарок, сенбернаров, ньюфаундлендов, боксеров и ротвейлеров патология, как ДТБС, служит классическим примером сложного типа наследования. ДТБС обусловлена не только большим количеством генов, но и факторами окружающей среды, влияющими на формирование болезни и степень ее проявления, вследствие чего генетическая диагностика ДТБС затруднена. В последние годы опубликованы данные полногеномных исследований, выявившие некоторые генетические факторы предрасположенности к ДТБС [10], разработаны даже первые ДНК-тесты [26], но, к сожалению, пока они имеют низкую диагностическую ценность. На сегодняшний день признанным методом диагностики этого серьезнейшего наследственного заболевания собак крупных пород служит рентгенография тазобедренного сустава, проводимая в возрасте двух лет, достоверность исследования 95,4 %. Достоверность рентгенографии у животных в возрасте до 1 года ниже и составляет около 70 %. Дальнейшее совершенствование генетических методов диагностики с целью определения предрасположенности к ДТБС в раннем возрасте имеет большое практическое значение.
Другие распространенные среди собак наследственные болезни, в том числе PLL, РКА, болезнь фон Вил-лебранда, нарколепсия, дефицит пируваткиназы, обусловлены наличием только одной или нескольких опасных мутаций в геноме, что позволяет разработать для них методики генетической диагностики.
Такое заболевание глаз, как PLL, характеризуется аномалией развития циннамоновых связок, в результате чего хрусталик выпадает из отверстия зрачка. Ответственная за развитие болезни нуклеотидная замена е.1473+1С>А на 5' конце интрона 10 гена АОАМГС17 в области сайта сплайсинга была выявлена в геноме многих пород и даже беспородных собак. Обычно болезнь дает о себе знать в возрасте 4.8 лет, хотя у некоторых животных, гомозиготных по мутации, болезнь не проявляется в течение всей жизни. Наиболее подвержены PLL мелкие и декоративные породы, в том числе разнообразные терьеры и пудели.
2. Перечень ДНК-тестов для выявления предрасположенности к наследственным болезням собак
ДНК-тест Заболевание Тип наследования Ген Мутация Характер изменений Порода
«PLL» рц_ AR ADAMTS17 c.1473+1G^A [6] Нарушение сайта сплайсинга Австралийская пастушья, американская эскимосская, бордер колли, вольпино итальяно, китайская хохлатая, китайская фу, лабрадор-ретривер, ланкашир хилер, миниатюрный бультерьер, терьеры, шар-пей и др.
«prcd-PRA» PRA AR PRCD c.5G^A [24] В кодирующей области аминокислотная замена Американский эскимосский шпиц, венгерский кувас, голден ретривер, йоркширский терьер, китайская хохлатая, кокапу, кокер-спаниель, лабрадор ретривер, лапинпорокойра, пудель, новошотландский ретривер, норвежский элкхаунд, португальская водная собака, финский лаппхунд, чесапик бей ретривер, энтлебухер зенненхунд и др.
«WF1» Болезнь фон Виллебранда 1-го типа AR vWF 7639 G^A [11] Нарушение сайта сплайсинга Доберман пинчер, бернский зенненхунд, дрентская куропаточная, немецкий пинчер, керои-блютерьер, манчестерский терьер, папильон, пемброк-вельшкорг, пудель, ирландский рыже-белый сеттер
«WF2» Болезнь фон Виллебранд 2-го типа AR vWF 88deLG [14] В кодирующей области делеция одного нуклеотида Немецкий короткошерстный пойнтер
«NR» Нарколепсия AR Hcrtr2 Инсерция SINE элемента, 3 интрон [15] Мутация в области сайта сплайсинга Доберман пинчер
+5G^A 6 экзон/ 6 интрон [15] То же Лабрадор ретривер
«PK-def» Дефицит пируваткиназы AR PKLR c.799C>T [9] В кодирующей области преждевременный стоп-кодон То же
с.848Т>С [9] В кодирующей области, аминокислотная замена Мопс
c.994G^ [9] То же Бигль
3. Результаты тестирования кошек некоторых пород на наличие в геноме мутаций, обусловливающих развитие наследственных болезней
ДНК-тест Заболевание Порода | Общее число животных (%) |
Всего Без мутации Гетерозигота Гомозигота
«PK» Поликистоз почек Персидская, экзотическая короткошерстная, британская короткошерстная 1532 1155 (75) 377 (25) 0
«НСМ» HCM Мейн-кун 1330 722 (54) 544 (41) 64 (5)
«SMA» CMA » 53 51 (96) 2 (4) 0
«PRA» PRA Абиссинская 24 17 (71) 6 (25) 1 (4)
«PK-def» Дефицит пируваткиназы » 17 6 (35) 9 (53) 2 (12)
| Примечание. Здесь и в табл. 4 темным цветом показаны больные животные, светлым — носители мутации |
4. Результаты тестирования собак некоторых пород на наличие в геноме мутаций, обусловливающих развитие наследственных болезней
ДНК-тест Заболевание Порода | Общее число животных (%) I
Всего Без мутации Гетерозигота Гомозигота
«PLL» РЫ_ Миниатюрный бультерьер, китайская хохлатая собака, джек рассел терьер, йоркширский терьер силихем терьер, лабродор ретривер 1538 870 (56) 598 (39) 70 (5)
«prcd-PRA» PRA Китайская хохлатая собака, лабрадор ретривер, йоркширский терьер, керн терьер, энтлебухер, зенненхунд, малый пудель, карликовый пудель, той пудель 386 346 (90) 40 (10) 0
«WF1» Болезнь фон Виллебранда 1-го типа Доберман пинчер, немецкий пинчер 82 51 (62) 30 (37) 1 (1)
В России ДНК-тест «PLL» пользуется наибольшей популярностью среди заводчиков собак породы миниатюрный бультерьер. Исследования, проводимые нами в течение двух лет, показали, что примерно 44 % отечественных миниатюрных бультерьеров несут ADAMTS17 с.1473+1С>Л мутацию, причем около 5 % находятся в высокой степени риска развития данного заболевания (гомозиготны по мутации). Распространена мутация ЛОЛМГС17 с.1473+1С>Л и среди китайских хохлатых собак: по данным, полученным в 2011—2012 гг., только 56 % собак указанной породы не несут генетической мутации, 38 % являются носителями мутации (гетерозигота), а 6 % подвержены РЬЬ (гомозиготны по мутации).
Другое достаточно распространенное среди собак различных пород заболевание глаз — РЯД, связано с поражением фоторецепторных клеток. Описано несколько типов заболевания —ранняя и поздняя формы РЯД с ЛЯ наследованием, а также форма, сцепленная с Х-хромосомой. Для таких пород, как энтлебухер зенненхунд, лабрадор ретривер, голден ретривер, китайская хохлатая собака, йоркширский терьер, пудель и некоторых других, характерна поздняя форма болезни типа ргс^РКД, обусловленная мутацией с.5С>Л в гене PRСD. В зависимости от породы и индивидуальных особенностей собаки клинические симптомы нарушений зрения при ргс^РЯЛ становятся заметны в возрасте 1.5 лет, при этом большинство собак полностью слепнут, способов лечения не существует. ДНК-тест «ргсіРЯЛ» позволяет установить предрасположенность животного к заболеванию и определить гетерозиготных носителей, способных передавать дефект потомству Посредством ДНК-теста «ргсс1-РЯЛ» было выявлено, что около 11 % собак породы китайская хохлатая и около 9 % лабрадоров ретриверов являются носителями PRСD с.5С>Л мутации, приводящей к развитию болезни. Сравнивая эти данные с опубликованными ранее [1], нельзя не отметить сокращение числа отечественных собак, пораженных РЯА.
Когда большая часть животных (более 30.. .40 %) поражена определенным наследственным заболеванием, полное исключение носителей опасной мутации из программы разведения может привести к уменьшению биологического разнообразия внутри породы и, более того, в значительной степени увеличит риск возникновения новых наследственных заболеваний. В таких случаях, в соответствии с рекомендациями АНТ, заводчики могут на первом этапе использовать в разведении всех породистых особей, не обращая внимания на их генотип, но только в паре с чистыми по ДНК-тесту животными. Применение подобной практики позволит постепенно (в несколько этапов) устранить носителей мутации из породы без риска уменьшения генетического разнообразия.
РВЖ • МДЖ • № 3/2013
Выводы
Таким образом, активное использование ДНК-тес-тов для выявления ряда опасных мутаций в геноме породистых кошек и собак позволило снизить в течение последних лет в России численность животных, имеющих предрасположенность к наследственным болезням.
Разработка и внедрение в ветеринарную практику новых генетических тестов, увеличение числа диагностических центров, информирование заводчиков о проблеме и возможностях ее решения, позволят минимизировать распространение наследственных болезней, а также улучшить генофонд породистых животных.
С распространением генетических тестов появляются и новые проблемы — фальсификации недобросовестными заводчиками генетического материала для получения позитивных результатов исследования пораженных животных. Чтобы исключить данную проблему, крупные лаборатории, в том числе ЦМД ФГБУ «ВгнКи», параллельно с ДНК-тестированием на наличие генетической предрасположенности к наследственным болезням, осуществляют мультилокусный анализ, позволяющий получить данные о длине микросаттелитных маркеров, составляющих уникальный для данного организма «генетический паспорт» [16]. Благодаря этому анализу удается идентифицировать животное без использования электронного чипа или клейма, что особенно важно при тестировании немаркированных животных и при исследовании материала, присланного в лабораторию по почте. Присутствие на бланке с результатами исследования и «генетического паспорта», представляющего маркировку с помощью длины микросателлитных маркеров, позволяет исключить подмену генетического материала, так как при каждом исследовании параллельно определяется уникальный код животного. Данные мультилокусного микросаттелит-ного анализа в дальнейшем могут быть использованы владельцами также для установления близкого родства между животными, например, отцовства.
